(一)無菌操作前的準備工作

培養材料接種時的無菌操作過程除上述各項消毒滅菌操作外，還需完成以下無菌操作步驟，從而獲得接種的無菌培養材料。

工作人員無菌操作前需用肥皂刷洗雙手及手臂，并用流水沖凈，并對手臂消毒后穿戴好滅菌工作服、工作帽和口罩，更換拖鞋，才能進入無菌操作區。如進入層流操作室進行實驗操作，應完成緩沖準備區內的淋浴、一次更換滅菌衣帽、拖鞋；手臂消毒、二次更換滅菌防護衣帽、手套、拖鞋等；再在風淋區進行無菌風淋后方可進入層流操作室。進入無菌操作區后，再用70%～75%的酒精擦拭雙手和前臂，完成無菌操作準備工作。

用70%～75%酒精擦洗工作臺面后，將已消毒滅菌的實驗用品取出，并將操作器械放置在無菌器械支架上，然后開始實驗操作。在實驗操作過程中，對所有操作器械每次使用后都要進行滅菌，常采用酒精燈火焰灼燒滅菌。

(二)無菌操作步驟

準備工作完成后，對來自于自然生長條件下的外植體，按上述培養材料消毒方法滅菌后取出，放入已滅菌的培養皿中，然后置超凈工作臺酒精燈火焰下方，用滅菌剪刀等器械進行適當分離、切割或其它處理后備用。

在酒精燈火焰處將培養容器的瓶塞(蓋)輕輕打開，瓶口在燈焰處旋轉灼燒，用鑷子將培養材料置入培養液上，將鑷子在酒精瓶中浸蘸酒精，置酒精燈上灼燒后放回支架，然后迅速灼燎瓶塞(蓋)數秒后塞回瓶口。對繼代培養材料的無菌操作，需在燈焰處打開瓶塞(蓋)，繼代材料為液體培養細胞時直接用滅菌吸管吸取培養細胞液放入新培養液中；繼代材料為固體培養細胞時用滅菌鑷子挑取適量材料置新培養液上；繼代材料為其他組織時，用滅菌剪刀或其他器械進行培養材料適當切割后，用滅菌鑷子將其置于新培養液上(中)，然后迅速灼燎瓶塞(蓋)數秒后塞回瓶口。

(三)污染源及其表現特征

當培養材料、轉接器皿、無菌操作環境等消毒滅菌不徹底時，培養材料則攜帶有微生物(microorganism)，當其被轉接到營養豐富的培養液上時，微生物繁殖迅速，出現各種污染菌斑。

微生物生長時分泌出對植物組織有毒的代謝廢物，致使培養材料死亡或失去使用價值。在培養過程中，培養材料附近出現黏液或混濁的水跡，并有發酵狀泡沫，這是細菌性污染。在細菌性污染中，特別要注意一種呈乳白色的芽孢桿菌污染，它可出現在培養液表面，或呈滴形云霧狀存在于培養液內，若出現應嚴格滅菌。而培養液表面出現的黃色、白色、黑色等不同顏色的霉菌，這是真菌性污染。